El cultivo de células es un conjunto de tecnologías para la biología utilizados para crecer las células fuera de su cuerpo ( ex vivo ) o su fondo, con el fin de experimentar científica o FIV .
Las células cultivadas pueden ser:
Los científicos están tratando de hacer crecer las células en el laboratorio desde el final del XIX ° siglo , pero no tuvo éxito debido a que las muestras de forma rutinaria mueren. En 1912, Alexis Carrel , un cirujano francés, logró cultivar las células de un corazón de pollo, que seguía latiendo. La comunidad científica de la época creía que su experimento era uno de los más importantes de la época, y las revistas aseguraban que conduciría a la inmortalidad de la célula, pero Carrel era eugenista y místico. Cada año celebraba el "cumpleaños" de las células, pero finalmente nos enteramos de que las células originales no sobrevivieron mucho tiempo y ningún científico había logrado replicar su experimento. De hecho, Carrel reintroducía nuevas células cada vez que las "alimentaba" con jugo de embriones.
El verdadero avance se produjo en 1951 cuando las células de Henrietta Lacks , conocidas como células HeLa , tomadas durante su cirugía de cáncer y cultivadas por el biólogo George Gay, demostraron ser "inmortales" al reproducirse sin cesar. Todavía se utilizan en el laboratorio en la actualidad.
El cultivo primario es uno de los sistemas de cultivo celular formado por el cultivo de células obtenidas directamente de los tejidos. Un cultivo primario comienza con la biopsia (~ 1 cm 3 ) del tejido u órgano por disección. Normalmente, las células tienen conexiones intercelulares, con la membrana basal o con la matriz celular. Para que las células se cultiven, estas conexiones deben romperse (suspensión de células individuales). Existen métodos de digestión enzimática o química en los que se utilizan diversas enzimas proteolíticas, como la tripsina o la colagenasa. Además, se pueden utilizar métodos de separación mecánica, como dividir el tejido con cuchillos quirúrgicos. Las suspensiones de células resultantes se purifican mediante un proceso de dilución y centrifugación en serie y se transfieren a recipientes de cultivo.
Dos o tres días después de cultivar las células, es necesario un cambio de medio de cultivo. En el caso de cultivos adherentes, el medio puede eliminarse directamente por aspiración y luego reponerse. En el caso de células no adherentes o suspendidas, el cambio del medio de cultivo debe ir precedido de una etapa de centrifugación a 200 g durante 10 minutos. Luego, el sedimento celular debe resuspenderse en medio fresco.
Como se describió anteriormente, las células en proliferación provocan el consumo de las sustancias requeridas rápidamente y el aumento de metabolitos y la disminución de sus áreas de proliferación en el medio de cultivo. En esta situación, la proliferación celular comienza a disminuir o cesa por completo. Con el fin de mantener la densidad celular óptima para un crecimiento continuo y para estimular una mayor proliferación, el cultivo primario debe transferirse a un nuevo entorno de cultivo en condiciones adecuadas, o pueden continuar proliferando. Este proceso se conoce como cultivo celular secundario. El primer paso en el cultivo secundario de células adherentes es separar las células del sustrato cuando las células alcanzan una alta confluencia. La tripsina se aplica a menudo para este propósito. A continuación, las células se subdividen y se vuelven a sembrar en cultivos frescos. El cultivo de células secundarias es necesario periódicamente para proporcionar a las células espacio de crecimiento y nutrientes frescos, lo que ayuda a prolongar la vida celular y aumentar el número de células en el cultivo.
El medio de cultivo celular es una mezcla compleja de nutrientes y factores de crecimiento que, junto con el entorno físico, pueden afectar el desarrollo celular. Los componentes de los medios de cultivo celular se pueden separar en las siguientes clases generales: agua, glucosa, aminoácidos, vitaminas, sales orgánicas e inorgánicas, lípidos y suplementos que pueden incluir proteínas, factores de crecimiento, hidrolizados y suero. Aparte de la línea celular, puede que no haya ningún otro factor que influya más fuertemente en la proliferación celular.
Dependiendo de los tipos de células y sus funciones, los requerimientos nutricionales y el pH difieren. A medida que el crecimiento celular continúa desde la siembra inicial hasta la confluencia o la densidad celular máxima, las células usarán aminoácidos y otros componentes a diferentes velocidades. Para optimizar el desarrollo celular adecuado, es necesario controlar el amoníaco, los radicales libres, la toxicidad por metales pesados, las variaciones de pH, las fluctuaciones en la osmolalidad, el agotamiento de nutrientes y los contaminantes químicos y biológicos.
Los medios se pueden clasificar de acuerdo con el grado de complejidad de los ingredientes indefinidos que se les agregan, como sueros animales, factores de crecimiento de proteínas y proteínas animales o vegetales hidrolizadas.
En el cultivo celular se utilizan varias placas y matraces de diferentes superficies. La siguiente tabla, descrita por Thermo Fisher Scientific , representa algunas cifras útiles como el área, la densidad de siembra y el volumen del medio de cultivo para recipientes de cultivo de varios tamaños. De hecho, el número de células en una placa o un matraz, así como el volumen de medio de cultivo requerido, varía según el tipo de células colocadas en cultivo. Las células HeLa se utilizan para esta tabla.
| Superficie (cm2) | Densidad de siembra | Volumen de medio de cultivo (mL) | |
|---|---|---|---|
| 6 pozos | 9,6 | 0,3 x 10 ^ 6 | 1-3 |
| 12 pozos | 3,5 | 2,1 x 10 ^ 6 | 1-2 |
| 24 pozos | 1,9 | 0,05 x 10 ^ 6 | 0.5-1 |
| 48 pozos | 1.1 | 0,03 x 10 ^ 6 | 0,2-0,4 |
| 96 pozos | 0,32 | 0,01 x 10 ^ 6 | 0,1-0,2 |
| T-25 | 25 | 0,7 x 10 ^ 6 | 3-5 |
| T-75 | 75 | 2,1 x 10 ^ 6 | 8-15 |
| Dónde comprar el 175 | 175 | 4,9 x 10 ^ 6 | 35-53 |
| T-225 | 225 | 6,3 x 10 ^ 6 | 45-68 |
La criopreservación es un método para congelar las células, manteniendo su viabilidad, hasta que se descongelen meses o años después. Estas son algunas de las ventajas de la criopreservación de células:
La mayoría de las veces, los microorganismos se cultivan en suspensión en medio de cultivo o en un medio nutritivo semisólido en placas de Petri . Las condiciones físico - químicas del crecimiento del cultivo de bacterias varían ampliamente, tanto en términos de temperatura , presión atmosférica , salinidad del medio, composición en biomoléculas e incluso brillo (ejemplo de ciertas cianobacterias).
Ver también el artículo sobre cultivo microbiológico .
Las células animales se cultivan generalmente en incubadoras , a una temperatura de 37 ° C y en una atmósfera muy húmeda con un contenido de CO 2 controlado, a menudo del 5%.
Algunas células se cultivan en suspensión en su medio nutritivo (células no adherentes), otras sobre plásticos tratados ofreciéndoles capacidades de adhesión . Estos soportes pueden presentarse en forma de cajas de diferentes tamaños o frascos . Las células también se pueden cultivar en entornos tridimensionales reconstituidos cerca de matrices extracelulares naturales (Matrigel). Se pueden aplicar técnicas de cultivo particulares a determinadas células, ya sean obligatorias para su supervivencia, bien para mejorar estas condiciones o el control de determinados parámetros durante los experimentos:
El cultivo celular se realiza a menudo en matraces y placas de pocillos múltiples almacenados en incubadoras de CO 2 . Las incubadoras regulan la temperatura (~ 37 o C), la humedad (~ 95%) y la atmósfera de gas (CO 2 , 5%) alrededor de las células, y también indirectamente el pH del medio de cultivo con un sistema tampón de bicarbonato. Estos parámetros, idealmente, deberían ser constantes y no ser una fuente de variación experimental.
Las células en cultivo son un material de estudio muy importante. Gracias a las ventajas que ofrecen, las células siguen siendo valiosas para la investigación básica y para aplicaciones directas. Los avances tecnológicos son importantes para enfrentar nuevos desafíos complejos, y la forma en que se cultivan las células in vitro es un área de intensa actividad.
Para satisfacer la demanda de la medicina regenerativa , el primer robot automatizado o sistemas de cultivos celulares aparecen en el mercado a principios del XXI ° siglo.
En 2010, L'Institut National des Sciences et Techniques Industrielles Avancées (AIST, JAPON) et Kawasaki Heavy Industries ont présenté le premier robot (dit R-CPX , pour Robotized - Cell Processing eXpert system ) capable de cultiver conjointement des cellules venant de plusieurs gente. Se trata de un bloque de 4 m de ancho y 2 m de alto compuesto por dos brazos robóticos que reproducen los movimientos de un técnico experimentado, en un ambiente desinfectado por vapor de peróxido de hidrógeno . Costaría alrededor de 100 millones de yenes , o +/- 800.000 €) y la empresa espera vender alrededor de 100 unidades en 10 años.
Desde la década de 2010, la aparición de un sistema de cultivo tridimensional (gel) ha permitido lograr grandes avances en el cultivo de sistemas multicelulares y la formación de organoides .